为什么要进行封闭?

在免疫测定中必须封闭自由表面。这对于很多方法如ELISA、protein arrays、immuno-PCR、Western blotting 或免疫组织化学都是正确的做法。

ELISA板或Western blotting膜的表面经过优化后，可有效地附着蛋白质或抗体。这样可以在表面以高密度的捕获抗体或捕获分子进行最佳分析。

这种优化的结果是，许多其他的蛋白或多肽都能附着在表面上。这种附着是可逆的。在不封闭表面的情况下，样本中的分析抗体、示踪剂、分析物或其他成分都会结合到表面上。这可能会导致错误的结果或高背景信号。即使不存在分析物，检测抗体直接连接到ELISA板孔也会产生信号。必须阻止这种情况发生。为了使各个表面的自由结合能力饱和，必须进行封闭。通过用致密的分子层覆盖表面而使该层没有间隙，从而实现饱和。

 

怎样进行封闭?

用捕获抗体（或抗原）包被ELISA 板后，必须封闭表面的自由结合位点。 封闭溶液中含有高浓度的封闭剂。在微孔中进行孵育。这导致封闭剂吸附到表面上的自由结合位点。 理想地，产生完全致密且无间隙的层。 孵育时间取决于封闭剂，并且可能非常短（如果使用非常好的封闭剂）。 通常，建议使用更长的孵育时间并选择适当的操作步骤。 孵化时间通常为1-2小时或过夜。

封闭后可继续进行后续测定。除了封闭步骤外，建议随后使用Liquid Plate Sealer® 进行封闭后板的稳定。这可以提高捕获抗体与分析物的结合能力，并且可以在灵敏度和可重复性方面改善某些测定的结果。 此外，可以将未使用的包被ELISA板保存更长的时间。该稳定剂与封闭剂一起在ELISA板的孔中孵育。Liquid Plate Sealer®用易于溶解的保护层覆盖捕获的抗体或包被的抗原。

该层有两个作用。首先，该层可以直接改善许多捕获抗体或抗原的结构构象。构象的改善发生在孵育以及后续的ELISA板的干燥过程中。与未处理的捕获抗体相比，此时的捕获抗体具有更高的结合能力。当ELISA板干燥后，该效应与包被的捕获分子有关，可以直接测量该效应。第二个作用是包被生物分子的长期稳定。稳定后，ELISA 板可在4°C下长时间保存。在大多数情况下，可以通过涂覆和存储许多板来简化实验室的操作程序。稳定化也可用于降低ELISA变异的效率。 Liquid Plate Sealer®的积极作用在很大程度上取决于所使用的生物材料（如抗体和抗原）。因此，通常不能基于单独的测定来定量阳性效果。

 

存在最完美的封闭剂吗?

没有完美的封闭剂可以适用于各种测定。封闭剂必须与相应的检测方法匹配，并且必须针对任何新的检测方法进行单独选择。对于优化的用于蛋白质或多肽结合的板和western blotting膜，基于蛋白质的封闭剂比其他封闭剂更有效。在大多数情况下，合成封闭剂的效率要比基于蛋白质或多肽的封闭剂低。

 

经典选择: 用BSA进行封闭

BSA-Block是基于BSA（牛血清白蛋白）的经典封闭剂。 BSA是最重要的蛋白质之一，可以以良好的纯度和适量的量用于研究应用。因此，它很早就被用作免疫测定中的封闭剂。它在使用过的许多测定方法中都有可靠的验证记录。产品BSA-Block是在经过认证的公司从纯化的BSA生产出来的。与所有基于BSA的溶液一样，封闭效果也不是最佳的。 BSA是一种蛋白质，它太大了，无法建立具有最佳密度的层。但是对于大多数测定来说，这是可以接受的，对于某些测定，BSA是最佳的封闭剂。有些抗体只有在BSA 存在时才显示最佳结合效率。某些抗体，作为包被抗体进行包被，之后用BSA封闭后可显示最佳结果。对于某些抗体，BSA-Block将显示出比任何其他封闭剂更好的测定结果，因为对捕获抗体具有直接的积极作用。结合随后使用Liquid Plate Sealer®作为包被抗体的稳定剂进行孵育，可以显著改善BSA对抗体的积极作用。与合成封闭剂相比，BSA的封闭效果极佳，但低于新型封闭的效果。

 

最高性价比的封闭剂

许多检测方法的开发是为了获得良好的产品性能、可重复性和经济性。对于此类检测，CANDOR已开发出基于肽的封闭剂SmartBlock™。其批间一致性与合成封闭剂的高一致性相当。SmartBlock™作为一种基于肽的封闭剂，可以在表面上很好地结合，也可以结合抗体或蛋白质。 另外，肽的化学优化增强了蛋白质结合表面上的结合。 因此，与许多其他封闭剂相比，其封闭效果更佳。尽管如此，它还是一款经济型产品，也可以用于Western blotting和ELISA试剂盒的生产。 对于免疫研究测定和应用，SmartBlock™是最高效的封闭剂。

 

最有效的封闭剂

多年来，酪蛋白在文献中已被描述为一种合适的封闭蛋白。酪蛋白的封闭效率通常优于BSA。酪蛋白提供了许多可商购的封闭剂。在生产过程中，通常会溶解并过滤酪蛋白以去除未溶解的成分。 CANDOR提供基于酪蛋白的封闭剂——The Blocking Solution。但是， 该封闭剂无法与其他厂家提供的常规酪蛋白封闭剂相提并论。高度纯化的酪蛋白在CANDOR开发的专有生产工艺中进行了化学修饰。在生产过程中，修饰的酪蛋白被片段化。结果是得到了一种光谱范围广泛且一致的不同大小片段的经修饰的酪蛋白溶液。尽管生产过程很困难，但批间一致性仍然非常好。每批The Blocking Solution在测定中都提供了相同的结果。从而被允许在GLP实验室或生产具有极低检测限的现代诊断中常规使用， 如现代生物标志物的诊断。独特的生产工艺带来极为有效的特色封闭剂。

与替代封闭剂如BSA相比，这款试剂极高的封闭效果可通过测量变异系数（cv）来轻松量化。通常，并非每种测定中都需要The Blocking S olution的极高功效。我们建议将The Blockin g Solution用于需要精确、可靠和可重现分析物定量分析的关键应用中，以及用于稀有和珍贵样本的分析。

 

哪种类型的封闭剂是不建议使用的?

我们建议您不要使用批次与批次之间成分差异很大或可能被污染的封闭剂。使用此类封闭剂，您可以观察到变化的结果或取决于批次的不同背景。此类封闭剂的使用不适用于GLP实验室等规范区域或人诊断试剂盒的生产。在这些区域中，不允许更改纯度， 这将意味着需要对每批产品进行广泛的验证。

这些不当的封闭剂包括基于奶粉的封闭剂和一些可商购的阻滞剂，例如基于鱼提取物和许多其他基于动物的提取物。 对于奶粉，应该提到的是，奶粉仅是食物，而不是用于实验室的化学药品。 奶粉可能是最便宜的封闭剂，但仅在污染引起的可变或不清楚的结果不是很关键的情况下才应使用。奶粉作为一种便宜的封闭剂应合理应用，在某些研究领域中用于测定，也可用于如大学里的教学实验用途。

为了获得可靠的结果，应避免使用奶粉或未纯化的封闭提取物。 如果材料的来源是标准化来源，并且采用标准化的生产和纯化方法，则基于鱼（或其他动物）提取物的封闭剂可能是合适的。 但这是理论上的观点，因为大多数供应商不保证标准化的来源、 纯化过程和良好的批间一致性。 因此很难在市场上找到这种封闭剂。

总之，有必要为每种检测方法寻找并找到合适的封闭剂。 在选择合适的封闭剂之前，必须明确测定质量或结果质量的重要性。 如果是珍贵的样本或需要可靠的结果（例如法规要求），则必须注意高封闭效率。 如果对结果质量的要求较低，也可以使用简单的封闭剂。如大学或高校里的教学和培训的分析，用奶粉处理则没有任何问题。