荧光膜片钳技术的发展

       2000年，Zheng与Zagotta共同努力，一种新的结合荧光记录和内面向外膜片钳模式的荧光膜片钳(PCF)技术应运而生，该技术最初设计解决环核苷酸门控(CNG)通道蛋白与cGMP结合所产生的化学能如何驱动通道被激活的问题.首次报道的荧光膜片钳研究中，将马来酰亚胺用Alexa Fluor488荧光标记后，观察其修饰CNG通道蛋白上的半胱氨酸(胞内C端环核苷酸结合域的C481位点)的作用，通过记录荧光信号判断修饰所引发的通道蛋白结构变化，从而影响cGMP与CNG通道蛋白结合以及通道的激活.实验时，采用一根开口大约为几微米的抛光玻璃电极，封接表达于包含半胱氨酸的离子通道蛋白的细胞膜表面，通过拉回玻璃电极使细胞表面撕下的一小块细胞膜附着于玻璃电极尖部，荧光团标记和记录都在这一平方微米尺度的细胞膜片上进行.荧光膜片钳允许在通道蛋白的胞内及胞外两侧记录荧光信号.由于荧光信号记录的是从一小片游离膜上包含的离子通道信息，由胞内组分所产生的自发荧光造成的污染被除去.这使得荧光信号的信噪比增加，从而得到更高的分辨率.当结合高度敏感性、低噪声的荧光探测器，荧光膜片钳可以记录到单独一个蛋白质分子，实现单分子实时记录.

       基于内面向外的荧光膜片钳被称为经典荧光膜片钳，而后不同的研究小组也陆续报道了全细胞模式、细胞贴附模式的荧光膜片钳，作为荧光膜片钳技术的扩展.Yang等将荧光膜片钳技术应用到HEK全细胞模式下温度敏感TRP离子通道的温度激活的实验研究中，采用全细胞模式，同时记录通道电流和荧光信号，使得荧光膜片钳最初的大部分优势得以保留，在电流发生阶段，全细胞荧光膜片钳只记录胞外标定的荧光团.到目前为止，荧光膜片钳被应用于CNG通道门控及构象变化关系,CNG通道蛋白亚基配比、HCN通道在超极化激活下配体结合和门控间的关系研究.Mony等应用荧光膜片钳结合荧光电压钳，对质子通道Hv1的门控研究揭示了通道激活过程中S1和S4的结构重排，指出两部分在通道活动中既相互独立又相互影响的特性.最近Nomura等将荧光膜片钳技术应用于细菌源的机械刺激敏感通道在人工构建的脂质膜中重组的方向特性研究.毫无疑问，膜片钳的多种钳制模式使开发荧光膜片钳新方法具有了许多优势.

荧光膜片钳技术优势

       荧光膜片钳技术对胞膜上离子通道的特异位点采用荧光标记，研究者可以直接观察发生在特定通道结构上的实时构象重排.半胱氨酸通过基因突变技术被引入到通道蛋白的兴趣位点，如果必要，通道蛋白上原有的半胱氨酸可以通过基因突变被全部替换以确保所有记录信号的特异性.半胱氨酸残基作为与巯基特异反应的荧光团的定位点，允许特异位点荧光团标定.电流和荧光信号被同时从同一组离子通道蛋白记录，这是荧光膜片钳与荧光电压钳的主要区别之一.电流信号，作为通道开放和离子流动的结果，可做为通道功能的指示器.当半胱氨酸附近的蛋白质结构重排影响到荧光团的量子产出、迁移率、与邻近的荧光团的距离变化等因素时，荧光发射也发生改变.这样，荧光团可作为蛋白质构象变化的高度敏感的报告基团.因为荧光信号不像离子电流信号那样依赖于离子通道孔区的开放，荧光记录为探究离子通道蛋白到达开放状态前的构象变化的时空信息提供了一个新的手段.荧光膜片钳作为一种全新的研究正常功能下通道蛋白分子活动的方法，可以广泛应用于任何通道类型，甚至可以尝试非通道的膜蛋白，如转运蛋白、受体蛋白等.研究也表明，荧光记录也可以成为高通量药物筛选中电流记录的有效替代.

      与直径1 mm的卵母细胞相比，分离的膜片要小得多.那么为什么还能得到足够强的荧光信号呢？这其中的原因主要有两个.第一，在HEK细胞膜上可以高密度地表达通道蛋白，对许多离子通道而言，从一片分离的细胞膜上可以得到几百到几千个通道分子，因为敏感的光学探测器(如CCD相机)可以观察单个荧光分子，成百上千个荧光分子所发出的荧光在检测上自然没有问题.第二，因为膜片很小，这样就可以使用高采光效率的光学镜头(如40倍数值孔径NA值大于1.4的高分辨物镜)采集整个膜片上所有的荧光信号.与之相比，卵母细胞虽然很大，但大多数荧光都没有被收集到.

       荧光膜片钳记录提供了优越的敏感性和时间分辨率，而且同荧光电压钳记录相比，荧光膜片钳可以直接控制胞内环境，优势如下：第一，可以面对离子通道胞内一侧并对相关区域进行标定；第二，排除了由胞内环境所造成的自发荧光，荧光探测敏感性大为提高；第三，可以施加胞内配体及通道调节分子来调节通道的门控；第四，电流记录具有更高的时间分辨率。

转自程为等生物化学与生物物理进展：荧光膜片钳新技术的应用及进展