膜片钳技术十个技术要点

 

动作轻柔

 

      当将micropipette放置到holder上的时候，你可以很容易的在你和放大器（amplifier）“热”电极之间产生电接触。如果不与地面电位（electrical ground）连接的话，那么就像是一个巨大的触角，会引起很大的噪音。这会造成一些放大器的损伤，尤其是如果你聚集了一些静电噪声的时候。利用空余的那只手接触地面，或者在放置微管之前连接金属丝到地面电位，后者可以在你作为法拉笼（Faraday cage，又称静电屏蔽笼，用以防止杂电场对膜片钳放大器的探头电路的干扰）一部分的时候减少噪音。

 

利用少许压力

      在靠近液体表面和接触细胞之前要在微管溶液中施以4-6英寸的水压，这可以通过膜片管holders另外的线路，用嘴更好——一个简单的U试管。这种电压能可以让bath中不留任何碎片，当然吸液管溶液也必须十分干净。

 

不用在意吸液管被打碎

       每一步由于对操纵器和光学方面的感觉不同都会有所差别，在将吸液管定位在细胞附近的时候，刚开始总是会打破几个吸液管的，这是十分正常的。不要因此而沮丧，要分型一下每次做错的原因，这样能获得很快的进步，而且在到下一步的时候依然要重复这个过程。

 

SUPERFUSION是开还是不开？

       打开Superfusion会导致一些化学物品的浪费，也许是昂贵的药物，而且会增加吸液管污染的可能性，但是，如果你的细胞并没有很好的贴在底物上，造成紧密的seal（没有superfusion），那么打开superfusion，能很容易的调整细胞，打破密封。另一持续打开superfusion的原因是微环境调控，除非你能很确定稳定和pH值不会大幅度的变化，那么还是让superfusion开着吧。

 

吸液管大小

       一个孔径尺寸大的吸液管有利于整个细胞的记录，这主要是因为用suction pulses容易穿过细胞膜，因此在记录的过程中不用重新再来，细胞质中吸液管溶液也可以很快得以交换。因此在整个细胞记录过程中吸液管的大小是由获得seals的成功率决定的，可以尽可能的考虑大尺寸的吸液管，电阻大约是2MΩ。另外小孔径的吸液管适合于单孔道记录。

 

选择正确的角度

       要进行一次好的密封就需要一次优良的接触，吸液管接触细胞的角度通常是45度到60度，在放置吸液管的时候，试着选择细胞上与吸液管轴垂直的部分。这不难，但是在平展的细胞上可能有些难得，有时可以利用由细胞核造成的凸出来完成。而纺锤形状的细胞则可以以90度来靠近其轴心。

 

吸出

       在靠近一个摆动检测脉冲（毫伏）的过程中就说明吸液管“看到”了电阻（电流反应越大电阻越低），接近细胞会增加电阻，降低电流反应。在许多例子中，大约10%的下降就说明要关掉suction，但是不同的细胞类型有不同的情况，而且超压应用的情况也有影响。也就是说，一旦一种细胞类型建立了可靠稳定的规则，那么就把它记录下来。从压力到吸出的转换（通常是由口来完成）应该是快速和顺畅的，如果你离开吸液管一会（没有压力或者sucion），那细胞膜就会摇摆，污染吸液管口，无法完成良好的seal。

 

承认错误

       如果发现你监控的电阻大幅度降低，那么放弃这一次。你的tip将会被污染，就像上面说的那样，无法得到好的密封，承认错误，用一只新的吸液管重新开始是最节约时间的方法。

 

鉴别和去除漂移

      有没有在利用显微操作器（micromanipulator）这种低漂移特征的仪器操作时，发现微吸管在显微镜下滑动？在对显微操作器抱怨之前，你需要确保你的操作器已调节减少振动了。漂移有可能是由于操作器装载过重，或者电缆和与headstage接触的试管扭转力过大，请尽量避免这些情况的出现。

 

当钳出来......

       在完成一个密封（seal）之后，可以加以holding potential。通常你所认为的是一个来自细胞的休眠细胞膜电压，在吸液管下的膜片将会被去极化，但是一旦你取出，细胞将不再能从放大器里获得强大的电流jolt。这种钳出可以通过吸出脉冲（suction pulse）或者电流脉冲（current pulse）完成。吸出对于尺寸大一些的吸液管（<3MΩ）比较合适，而另一个则适合于小吸液管（>6MΩ），中间的范围需要反复试验，但是一旦你对你的细胞有了一套方法，那么就坚持下去，有时一些污染会骗了你。用小量持续的suction，而电流脉冲则可以不断的增加，如果你看到许多噪音出现，回到原来的suction脉冲。

 

转自生物通（英国赫特福德郡大学细胞与膜生理学的Areles Molleman原创）