检测细胞因子是判断机体免疫功能的一个重要指标。运用荧光标记的抗细胞因子单抗进行胞内流式分析(Intracellular Flow Cytometry,ICFC)结合荧光标记的抗细胞表面抗原单抗应用,不仅可以检测单个细胞内的多种因子,还可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。

      应用ICFC检测细胞因子的一般步骤:

       （1）活化细胞：淋巴细胞、嗜碱细胞、嗜酸细胞、抗原提呈细胞(如树突状细胞和纤维细胞)均可产生细胞因子。目前用于流式细胞术检测的多是淋巴细胞、PBMC和全血。除在病理情况下, 对过高表达的细胞因子可直接取样品细胞进行检测外,通常检测细胞因子一般都需要先激活细胞。PMA 和离子霉素为常用的激活剂, 他们可作用于蛋白激酶C ( PKC）使细胞活化并产生细胞因子。待检细胞同激活剂共孵育的时间因细胞类型的不同而异, 一般孵育4～6 h足够。值得注意的是, 一些细胞可因PMA和离子霉素的刺激而死亡, 且随着孵育时间
的延长(超过24 h)死亡的细胞数增多。死亡的细胞可释放DNA链, 诱导其他细胞形成细胞团而干扰对后续步骤的分析, 并可严重影响检测的结果, 因此, 必须控制细胞的死亡数。

      （2）抑制蛋白转运　在激活细胞的同时, 需用细胞内蛋白转运抑制剂(常用的是Monensin和Brefeldin A)使其产生的蛋白质积聚在细胞内, 以增加检测信号的强度。但由于Monensin和BFA具有时间- 剂量依赖的细胞毒性, 因此处理细胞的时间不能过长, Monensin的处理时间若超过12 h, 可对细胞产生毒性。若需长时间激活细胞, 应在激活的最后阶段加入抑制剂。若以抗原肽作为刺激物, 由于不需要抗原加工的过程, 因此, 从一开始孵育细胞时, 就加入BFA。对于大多数细胞因子, BFA 和Monensin这两种蛋白转运抑制剂都一样有效, 但也有例外, 如BFA用于检测TNF-α效果最好; 而在用LPS作为激活剂检测人PBMC分泌的IL-10时应该用Monensin, 否则将检测不到IL-10。

      （3）封闭Fc受体　许多细胞表面表达Fc受体, 如B细胞、NK细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞及血小板等。他们会非特异性地结合检测抗体的Fc段造成高背景, 因此, 封闭Fc受体的目的在于减少非特异性免疫荧光染色。在用IgFc受体的封闭试剂处理细胞时, 对人和大鼠细胞可用过量与荧光抗体来源相同、但亚型无关的纯化Ig或血清, 来阻断Fc受体;而对小鼠细胞可用纯化的抗CD16 /32 抗体直接染色以封闭Fc受体。

      （4）细胞表面分子染色 T细胞表面可表达CD3、CD4或CD8分子, 但BFA和Monensin都可能影响细胞表面分子的表达,如BFA可使CD4的表达下调, 也可抑制大多数CD3 +细胞表面表达CD69, 但不影响细胞内CD69的表达; 而Monensin则不会显著抑制细胞表面CD69的表达。其他如CD3、CD8、TCR也可受到影响。所以, 目前多采用淋巴细胞和中性粒细胞早期活化的标志CD69, 作为鉴定活化T细胞的表面标志。

      （5）固定和破膜　固定和破膜一般同时进行。固定细胞是细胞因子检测步骤中极为关键的环节。常用的固定剂多聚甲醛能保护细胞形态的完整性和细胞内物质的抗原性, 也可防止破剂渗入细胞。由于一些细胞表面分子在经多聚甲醛处理后会遭破坏, 所以应在细胞表面分子染色后再适时加入固定剂。常用的破膜剂是皂角苷, 如果没有皂角苷的渗透作用, 荧光素标记的抗体只能与细胞外或细胞表面的抗原结合。破膜剂可增加细胞膜的通透性, 在细胞膜上形成传递通道, 荧光素标记的抗体便可通过细胞膜和细胞质渗入到内质网上的高尔基复合体, 与细胞因子或胞内其他分子结合。

     （6）细胞内细胞因子染色　固定和破膜后, 对细胞因子进行荧光染色最常用的为PE、FITC标记的抗体和APC标记的抗体。由于不同抗体所针对的抗原表位不同, 应选用不同的荧光素标记。对于弱表达的抗原(如IL-4)的检测, 应选用强的荧光素PE标记抗体; 对高表达的IFN-γ的检测推荐用FITC标记抗体。

    （7）上机检测 洗涤细胞后, 通过三色或四色的多参数流式细胞分析。检测的数据是表面Marker和细胞因子双阳性的细胞数占所设定细胞数的百分率。

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