诊断试剂盒中试剂等组分的稳定性对于商业化的检测至关重要。现今稳定剂不仅可以延长保质期，而且可以提高检测试剂盒的可靠性。以SARS-CoV-2抗原为例，我们将解释商业化稳定剂如何在优化工作流程的同时提高分析质量。
如果在开发过程中没有充分考虑组分的稳定性，即使是技术上最先进、设计最完善的诊断检测，通常也无法实现商业化。根据将于2022年5月生效的欧盟体外诊断法规（IVDR），诊断试剂盒的分析性能在其保质期内不得改变。这使得保证组分的稳定性成为试剂盒进入市场的先决条件。通过使用商业化的蛋白质和结合物稳定剂，例如CANDOR的Antibody Stabilizer、HRP-Protector™和AP-Protector®，可以大大提高对照品和检测抗体-结合物的稳定性。本文以ELISAs为例，重点讨论固相稳定、表面包被捕获分子的活性维持的机理和解决方案。此外，本文概述的原理和解决方案也可以应用于其他包被表面，如聚苯乙烯或玻璃表面的实验应用，如侧向层析、亲和柱、基于微球的分析、免疫PCR或蛋白质分析等。
包被的捕获分子如抗体，或在抗原下降分析中分离的病毒蛋白，是可靠免疫分析的核心组成部分。它们的错误折叠，如天然结构的丢失，是任何分析的一个重大问题，因为它会引起抗体结合部位、抗体的抗原结合区或抗原的表位的改变，这两者都是待测物结合所必需的。因此，捕获分子无法结合待测物，甚至可能由于暴露天然未暴露的氨基酸序列和结构而发生非特异性结合，导致诊断试验显示错误的结果。由于表面效应引起的空间结构和构象的改变，抗体在包被过程中会发生错误折叠。在ELISA微孔板中，只有3-10%的包被抗体具有良好的定向性和与待测物结合的功能活性。抗原包被也有类似的情况。在大多数情况下，很少量的活性成分就足以完成一次检测，因为捕获分子通常使用大量过剩。
即使在成功包被后，错误折叠也会因为时间和温度的变化而发生。随着时间的推移，包被分子会失去结合待测物的能力。如果包被板是预期保质期为几年的诊断试剂盒的一部分，则最先进的稳定性对于其性能维持至关重要。否则，由于信噪比降低和潜在的非特异性相互作用，试剂盒的性能会随着捕获分子的错误折叠而降低，从而导致假阴性和假阳性。尤其是单克隆抗体在表面上的稳定性通常较低。在抗原下降分析中，一些包被抗原在不添加稳定剂的情况下，4℃储存两周后会失去捕获待测物的能力。
因此，在开发商业化试剂盒的早期，应考虑其稳定性。简单的方法，如使用BSA作为稳定剂，对包被捕获分子的稳定性没有显著影响，并且无法保持板的功能性（Fig.1a）。更有效的是自20世纪80年代以来诊断生产中使用的的糖或碳水化合物溶液。这些溶液能够在确保持续制冷的情况下充分维持包被板的稳定性，从而成为第一个真正的固相稳定剂。这种以糖为基础的稳定剂通常可保持板的保质期在一年的范围内，但在此期间质量略有下降是常见的。由德国CANDOR BIOSCIENCE提供的Liquid Plate Sealer®（Fig.1b），与碳水化合物溶液相比，具有更多的优势，而不仅仅是进一步提高了板的稳定性。
Figure 1: Calibration curves of an ELISA that was either blocked only with BSA (left panel) or blocked with BSA and additionally stabilized with Liquid Plate Sealer® (right panel).
由于干燥过程中水化膜的蒸发和与空气的直接接触，蛋白质的二级和三级结构被破坏，从而失去活性。为了防止这种错误折叠，有必要用一个封闭而均匀的保护层来密封包被的捕获分子。这是现代包被稳定剂的主要作用模式，如Liquid Plate Sealer®。除这一基本功能外，很多情况下，Liquid Plate Sealer®（由于成分削弱了表面的负面影响）还可以重新激活一些在包被过程中错误折叠的抗体或蛋白质，从而导致发挥功能的抗体的增加。由Liquid Plate Sealer®形成的保护层即使在温度应力下也能保持捕获分子的构象。尽管其优异的保护性能，但形成的层很容易溶解，因此稳定过的ELISA板储存后无需额外洗涤，样品可以直接添加入其中。
除了保持分析性能，现代固相稳定剂也有助于优化生产过程。更长的保质期允许更多的生产批次，因为试剂盒可以保存更长的时间。这不仅降低了成本，因为它节省了批量放行和机器设置时间，而且还减少了批间差异，因为客户可以延长使用同一批的时间。现代稳定剂（如Liquid Plate Sealer®）的高批次间一致性进一步补充了这一点。更长的保质期也有利于手工实验室分析，因为它们经常用于检测SARS-CoV-2抗体，因为更大的批量可以节省制备时间，并改善这些设置中的分析间差异，从而产生更具可比性和可靠性的结果。
此外，Liquid Plate Sealer®也可作为封闭剂，用于经典夹心法ELISA中进行一步到位的表面封闭和稳定（Fig.2）。这种操作步骤的减少可以优化诊断试剂盒的大规模生产过程，并降低成本。然而，有些分析需要更有效的表面封闭。在这种情况下，一个优越的表面封闭剂，如PlateBlock™ 对于SARS-CoV-2抗体的血清学检测或The Blocking Solution对于夹心法ELISA检测，是更好的选择。这两款表面封闭剂都是由CANDOR开发的，用于高质量的免疫诊断。Liquid Plate Sealer®与目前测试的所有表面封闭试剂兼容。
Figure 2: High-speed ELISA plate production with Liquid Plate Sealer® as blocking reagent and coating stabilizer in a single process step is suitable for sandwich ELISA and competitive tests.
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